FXYD3 CRISPR Activation Plasmid (h2): sc-406431-ACT-2

Das humane FXYD3 kodiert einen kleinen, eintransmembranigen Regulator der Na⁺/K⁺-ATPase, der die Kinetik der Pumpe moduliert und dadurch die zelluläre Ionenhomöostase, das Membranpotenzial und die Volumenregulation in epithelialen Kontexten beeinflusst. Über seine Kontrolle des Natrium- und Kaliumtransports wirkt FXYD3 auf nachgeschaltete Prozesse, die mit Proliferation, Differenzierung und Stressanpassung verbunden sind und mit Signalnetzwerken verknüpft sind, die empfindlich auf das ionische Gleichgewicht reagieren. Eine veränderte FXYD3-Expression wurde in mehreren Karzinomen und anderen epithelialen Pathologien beschrieben, was seine Relevanz für Studien zur dysregulierten Transportbiologie sowie zu tumorassoziierten metabolischen Veränderungen und Veränderungen des Mikromilieus untermauert. Die Geneditierung oder gezielte Perturbation von FXYD3 ermöglicht die mechanistische Untersuchung der Regulation der Na⁺/K⁺-ATPase, der Proteostase von Membranproteinen und ionenabhängiger Phänotypen in humanen Zellmodellen, einschließlich funktioneller Assays zur Pumpaktivität, Migration und zu Eigenschaften der epithelialen Barriere.

FXYD3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FXYD3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

FXYD3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FXYD3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FXYD3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen FXYD3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FXYD3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von FXYD3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des FXYD3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FXYD3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.