Plasmide CRISPR d'Activation (h) FRP-1: sc-402086-ACT

SFRP1 code la protéine sécrétée « secreted frizzled-related protein 1 » (FRP-1), un modulateur soluble de la signalisation Wnt qui se lie aux ligands Wnt et peut influencer leur interaction avec les récepteurs Frizzled. En façonnant des programmes transcriptionnels dépendants de la β-caténine, FRP-1 affecte la prolifération et la différenciation cellulaires, la dynamique épithélio-mésenchymateuse et l’homéostasie tissulaire. Une expression altérée de SFRP1 est fréquemment associée à une dérégulation de l’activité de la voie Wnt/β-caténine en oncologie, ainsi qu’à des processus de remodelage impliqués dans la fibrose et les réponses tissulaires inflammatoires. En tant que régulateur sécrété, FRP-1 est également pertinent pour l’étude de la signalisation paracrine et des interactions entre voies induites par le microenvironnement.

FRP-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SFRP1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

FRP-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SFRP1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SFRP1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de FRP-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SFRP1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de FRP-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie FRP-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de SFRP1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.