Plasmide CRISPR d'Activation (h) frizzled-3: sc-403362-ACT

FZD3 code la frizzled-3, un récepteur Wnt à sept domaines transmembranaires qui convertit des signaux Wnt extracellulaires en programmes de signalisation intracellulaire régulant la polarité, la migration et la différenciation cellulaires. En tant que composant central des voies Wnt, frizzled-3 peut influencer la transcription dépendante de la β-caténine ainsi que la signalisation non canonique de polarité planaire et celle associée au calcium, selon le ligand et le contexte cellulaire. L’activité de FZD3 est étroitement liée à des processus neurodéveloppementaux tels que le guidage axonal et l’organisation synaptique, et une dérégulation de la signalisation Wnt–FZD a été associée à une prolifération anormale et à des phénotypes invasifs dans des modèles pertinents pour le cancer. Ces propriétés font de frizzled-3 un nœud utile pour étudier l’architecture des réseaux Wnt, la spécificité récepteur–ligand et le dialogue entre voies de signalisation dans les cellules humaines.

frizzled-3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de FZD3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

frizzled-3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus FZD3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription FZD3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de frizzled-3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus FZD3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de frizzled-3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie frizzled-3 dans les cellules tumorales présentant une expression de FZD3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.