Plasmide CRISPR d'Activation (h) FOXE3: sc-404466-ACT

FOXE3 (forkhead box E3) code un facteur de transcription de type forkhead/« winged-helix » qui régule des programmes d’expression génique indispensables au développement oculaire, en particulier la formation de la placode cristallinienne, le maintien de l’épithélium du cristallin et la différenciation. Par une liaison spécifique aux séquences d’ADN, FOXE3 coordonne des réseaux transcriptionnels qui influencent le contrôle du cycle cellulaire, l’identité épithéliale et l’engagement de lignée dans les tissus du segment antérieur. Une fonction FOXE3 dérégulée ainsi que certaines variantes génétiques sont associées à des affections oculaires congénitales, notamment la dysgénésie du segment antérieur, la microphtalmie et des phénotypes liés à la cataracte, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude du contrôle transcriptionnel du développement. FOXE3 est donc largement utilisé comme outil moléculaire pour modéliser la biologie du cristallin et pour cartographier les régulateurs en amont et les effecteurs en aval de la signalisation des facteurs forkhead.

FOXE3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de FOXE3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

FOXE3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus FOXE3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription FOXE3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de FOXE3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus FOXE3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de FOXE3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie FOXE3 dans les cellules tumorales présentant une expression de FOXE3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.