FOXD3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402673-ACT

FOXD3 (forkhead box D3) è un fattore di trascrizione della famiglia forkhead che svolge ruoli centrali nella definizione dei pattern embrionali precoci, nella specificazione della cresta neurale e nel mantenimento di stati trascrizionali associati alla pluripotenza. Coordinando l’impegno di linea e reprimendo programmi di differenziamento prematuri, FOXD3 si integra con reti di regolazione genica dello sviluppo che intersecano il rimodellamento della cromatina e le vie di segnalazione delle cellule staminali. Un’espressione deregolata di FOXD3 è stata implicata in alterazioni del controllo del destino cellulare, nella plasticità delle cellule tumorali e in programmi trascrizionali di adattamento allo stress, rendendolo un nodo utile per studiare i meccanismi di metastasi, resistenza alle terapie e disturbi dello sviluppo. Nei sistemi modello umani, l’attività di FOXD3 viene comunemente esaminata nel contesto delle dinamiche di repressione/attivazione trascrizionale, dell’utilizzo degli enhancer e del controllo epigenetico delle traiettorie di linea.

FOXD3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FOXD3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FOXD3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FOXD3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FOXD3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FOXD3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FOXD3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FOXD3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FOXD3 nelle cellule tumorali con espressione di FOXD3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.