Plasmide CRISPR d'Activation (h) fish: sc-401277-ACT

SH3PXD2A code pour la protéine adaptatrice Tks5, une protéine d’échafaudage qui coordonne le remodelage du cytosquelette d’actine et la dynamique membranaire au niveau des invadopodes et de structures protrusives apparentées. Grâce à ses domaines SH3 et PX, Tks5 intègre la signalisation des phosphoinositides aux voies dépendantes de Src afin d’organiser le trafic des protéases, la dégradation de la matrice extracellulaire et la migration cellulaire. La fonction de SH3PXD2A est associée à des phénotypes invasifs et à des programmes de remodelage tissulaire, ce qui la rend pertinente pour l’étude des signalisations liées aux métastases, de la morphogenèse du développement et des microenvironnements inflammatoires. Une expression ou une activité dérégulée de SH3PXD2A a été associée à des altérations de la motilité cellulaire et des interactions avec la matrice observées dans de multiples contextes cancéreux.

fish Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SH3PXD2A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

fish Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SH3PXD2A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SH3PXD2A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de fish. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SH3PXD2A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de fish au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie fish dans les cellules tumorales présentant une expression de SH3PXD2A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.