FIH-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402511-ACT

HIF1AN kodiert den Faktor, der HIF‑1 hemmt (FIH‑1), eine Fe(II)/2‑Oxoglutarat‑abhängige Asparaginylhydroxylase, die hypoxieinduzierbare Transkription abschwächt, indem sie HIF‑1α hydroxyliert und dadurch die Rekrutierung von Koaktivatoren (CBP/p300) begrenzt. Über diesen posttranslationalen Kontrollpunkt verknüpft FIH‑1 innerhalb des HIF‑Signalwegs die Sauerstoffsensorik mit metabolischer Umprogrammierung, angiogener Signalübertragung und Redox‑Homöostase. FIH‑1 modifiziert zudem Proteine mit Ankyrin‑Repeats und koppelt damit die Sauerstoffverfügbarkeit an umfassendere transkriptionelle und Signalnetzwerke. Eine fehlregulierte HIF‑Signalgebung und eine veränderte HIF1AN‑Aktivität wurden mit hypoxiegetriebenen Phänotypen in Verbindung gebracht, die für die Krebsbiologie sowie für Mechanismen von Ischämie, Entzündung und Stoffwechselerkrankungen relevant sind.

FIH-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HIF1AN-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

FIH-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HIF1AN-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HIF1AN-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen FIH-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HIF1AN-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von FIH-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des FIH-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HIF1AN-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.