Plasmide CRISPR d'Activation (m) fetuin-A: sc-419056-ACT

Chez la souris, Ahsg code la fétuine-A, une glycoprotéine sécrétée d’origine hépatique qui circule et agit comme régulateur multifonctionnel du métabolisme minéral et de la signalisation inflammatoire. La fétuine-A se lie au calcium et au phosphate pour former des particules calciprotéiques solubles, limitant les dépôts minéraux ectopiques et influençant les processus de minéralisation de la matrice extracellulaire. Elle module également la signalisation du récepteur de l’insuline et les réponses immunitaires innées, reliant les programmes de sécrétion du foie à l’homéostasie métabolique systémique. Des variations de l’abondance de fétuine-A ont été associées à des dysfonctionnements métaboliques, à des phénotypes de stéatose hépatique et à des pathologies anormales liées à la calcification dans des modèles précliniques, ce qui en fait un nœud mécanistique pertinent en recherche cardiométabolique et sur la minéralisation.

fetuin-A Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Ahsg sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

fetuin-A Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Ahsg dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Ahsg, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de fetuin-A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Ahsg natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de fetuin-A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie fetuin-A dans les cellules tumorales présentant une expression de Ahsg silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.