Plásmido CRISPR de Activación (h) fetuin-A: sc-401125-ACT

AHSG codifica la fetuina-A, una glucoproteína secretada por el hígado que circula en alta abundancia y modula la señalización extracelular al unirse a iones minerales y a diversos ligandos. La fetuina-A participa en la regulación de la biomineralización y la calcificación al formar complejos solubles con calcio y fosfato, y puede influir en la señalización de receptores y en la actividad de proteasas en el medio extracelular. En contextos metabólicos e inflamatorios, la fetuina-A se ha relacionado con la modulación de la señalización del receptor de insulina, la activación inmunitaria asociada a lípidos y la comunicación endocrina hepática. La expresión desregulada de AHSG o los niveles alterados de fetuina-A se han asociado con rasgos cardiometabólicos, estados inflamatorios crónicos y fenotipos de calcificación ectópica, lo que la convierte en un nodo útil para estudiar las vías de la homeostasis sistémica.

fetuin-A El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de AHSG sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

fetuin-A El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus AHSG en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional AHSG, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de fetuin-A. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo AHSG y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de fetuin-A en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía fetuin-A en células tumorales con expresión de AHSG silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.