Plasmide CRISPR d'Activation (h) ferritin heavy chain: sc-418152-ACT

FTH1 code la chaîne lourde de la ferritine, une sous-unité à activité ferroxydase du complexe ferritine qui convertit Fe2+ en Fe3+ et permet le stockage du fer, limitant ainsi le fer labile et les dommages oxydatifs catalysés par le fer. En tamponnant le fer intracellulaire, FTH1 influence l’homéostasie rédox, le métabolisme mitochondrial et le réseau « iron-responsive element/iron regulatory protein » (IRE/IRP), qui coordonne l’absorption, l’utilisation et le stockage du fer. La chaîne lourde de la ferritine intervient également dans les programmes de réponse au stress et dans des voies de mort cellulaire dépendantes du fer, telles que la ferroptose, via son contrôle de la disponibilité du fer. Une expression dérégulée de FTH1 ou une altération de la fonction de la ferritine est associée à des réponses au stress oxydatif perturbées et à une mauvaise gestion du fer observées dans la biologie des cancers, les maladies neurodégénératives et les affections inflammatoires.

ferritin heavy chain Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de FTH1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ferritin heavy chain Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus FTH1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription FTH1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ferritin heavy chain. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus FTH1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ferritin heavy chain au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ferritin heavy chain dans les cellules tumorales présentant une expression de FTH1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.