Plasmide CRISPR d'Activation (h) FEN-1: sc-403168-ACT

Le gène humain FEN1 code la flap endonucléase 1 (FEN-1), une nucléase spécifique de structure essentielle au traitement des intermédiaires en « flap » 5′ lors de la maturation des fragments d’Okazaki et de la réparation par excision de base à long patch. FEN-1 coordonne son action avec PCNA, les ADN polymérases δ/ε et l’ADN ligase I afin de maintenir la progression de la fourche de réplication et l’intégrité du génome, et contribue à la stabilité des télomères ainsi qu’à la résolution des structures de réplication bloquées. Une activité ou une expression dérégulée de FEN1 est associée au stress réplicatif, à l’instabilité chromosomique et à des altérations de la signalisation de la réponse aux dommages de l’ADN, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude de la mutagenèse et des défauts de maintenance du génome liés au cancer. En tant que nœud central de la réplication et de la réparation de l’ADN, FEN-1 est fréquemment étudiée dans les voies qui régissent les points de contrôle du cycle cellulaire, le choix des voies de réparation et les mécanismes de résistance aux agressions génotoxiques.

FEN-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de FEN1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

FEN-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus FEN1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription FEN1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de FEN-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus FEN1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de FEN-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie FEN-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de FEN1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.