Plasmide CRISPR d'Activation (h) FBXO3: sc-403436-ACT

FBXO3 code une protéine à domaine F-box qui agit comme composant de reconnaissance du substrat au sein des complexes ligases E3 ubiquitine SCF (SKP1–CUL1–F-box), contribuant à orienter des protéines spécifiques vers l’ubiquitination et leur dégradation par le protéasome. Par une dégradation protéique régulée, FBXO3 peut influencer la signalisation de l’immunité innée et les réponses inflammatoires, notamment des voies qui convergent vers des programmes transcriptionnels dépendants de NF-κB. Une activité altérée de FBXO3 a été associée dans la littérature à une dérégulation des réponses cytokiniques et à des états cellulaires liés au stress, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude de l’homéostasie immunitaire et des mécanismes de maladies associées à l’inflammation. En tant qu’élément du système ubiquitine–protéasome, FBXO3 est également utile pour explorer les réseaux de protéostasie et le contrôle, dépendant du contexte, d’intermédiaires de signalisation.

FBXO3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de FBXO3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

FBXO3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus FBXO3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription FBXO3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de FBXO3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus FBXO3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de FBXO3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie FBXO3 dans les cellules tumorales présentant une expression de FBXO3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.