Plasmide CRISPR d'Activation (h) FBXO25: sc-405092-ACT

Le gène humain **FBXO25** code une protéine à boîte F qui sert de composant de reconnaissance des substrats au sein des complexes ligases E3 ubiquitine **SCF** (SKP1–CUL1–F-box), aidant à orienter des protéines spécifiques vers l’ubiquitination puis leur dégradation dépendante du protéasome. Par une dégradation protéique régulée, FBXO25 contribue au contrôle de la progression du cycle cellulaire, des voies de signalisation activées en réponse au stress et au maintien de la protéostasie. Une perturbation de la signalisation ubiquitine médiée par SCF peut remodeler les programmes transcriptionnels et l’homéostasie cellulaire, reliant une activité F-box altérée à des phénotypes pertinents pour les maladies en oncologie et en neurobiologie. FBXO25 présente donc un intérêt pour disséquer l’architecture de la voie ubiquitine–protéasome et ses effets en aval sur la signalisation et l’expression génique.

FBXO25 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de FBXO25 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

FBXO25 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus FBXO25 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription FBXO25, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de FBXO25. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus FBXO25 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de FBXO25 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie FBXO25 dans les cellules tumorales présentant une expression de FBXO25 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.