Plasmide CRISPR d'Activation (m) Fatso: sc-424024-ACT

Le gène murin **Fto** code la protéine **Fatso**, une dioxygénase dépendante du Fe(II) et du 2‑oxoglutarate qui agit comme déméthylase de l’ARN en régulant de manière réversible la **N6‑méthyladénosine (m6A)** et d’autres marques de méthylation de l’ARN. En modulant l’épissage, la stabilité et la traduction de l’ARN, Fatso influence des programmes d’expression génique liés à l’homéostasie énergétique, à l’adipogenèse et aux voies de signalisation métaboliques. L’activité de Fto s’articule avec des réseaux de détection des nutriments et affecte les transitions d’état cellulaire via le contrôle post‑transcriptionnel de transcrits impliqués dans la fonction mitochondriale et les réponses au stress. Une expression ou une activité dérégulée de Fto a été associée, dans des systèmes modèles, à des phénotypes liés à l’obésité, à des altérations du métabolisme du glucose, ainsi qu’à des traits cardiométaboliques et neurocomportementaux plus larges.

Fatso Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Fto sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Fatso Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Fto dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Fto, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Fatso. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Fto natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Fatso au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Fatso dans les cellules tumorales présentant une expression de Fto silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.