Plasmide CRISPR d'Activation (h) FANCM: sc-403495-ACT

Le gène humain **FANCM** code une translocase de l’ADN qui intervient dans la voie de l’anémie de Fanconi (FA) afin de maintenir la stabilité du génome en cas de stress de réplication. FANCM reconnaît les fourches de réplication bloquées et les liaisons interbrins, et coordonne son action avec le complexe central FA, la signalisation de point de contrôle dépendante d’ATR et les facteurs de recombinaison homologue pour favoriser le remodelage et la réparation des fourches. Par ses rôles dans le franchissement des fourches de réplication, leur redémarrage et la suppression des recombinaisons aberrantes, FANCM contribue à limiter les cassures chromosomiques et la mutagenèse. La perturbation de la réparation médiée par FANCM est associée à une capacité réduite de réparation des pontages interbrins et à des phénotypes d’instabilité génomique pertinents pour la biologie de l’anémie de Fanconi et les altérations de la réponse aux dommages de l’ADN observées dans les cancers.

FANCM Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de FANCM sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

FANCM Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus FANCM dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription FANCM, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de FANCM. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus FANCM natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de FANCM au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie FANCM dans les cellules tumorales présentant une expression de FANCM silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.