Plasmide CRISPR d'Activation (h) FANCL: sc-403812-ACT

FANCL code une ligase E3 d’ubiquitine qui agit comme composant catalytique central de la voie de réparation de l’ADN de l’anémie de Fanconi (FA), en coordonnant la réparation des liaisons croisées interbrins de l’ADN et des lésions associées à la réplication. Au sein du complexe central FA, FANCL assure la monoubiquitination de FANCD2 et de FANCI, permettant le recrutement de nucléases en aval et de facteurs de recombinaison homologue vers les fourches de réplication bloquées. Cette activité soutient la stabilité du génome, l’intégrité du point de contrôle de la phase S et la tolérance cellulaire au stress génotoxique. La dérégulation de la signalisation dépendante de FANCL est liée à la biologie de l’anémie de Fanconi, à l’instabilité chromosomique et à des défauts de réparation de l’ADN pertinents pour la recherche sur le cancer et l’insuffisance hématopoïétique.

FANCL Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de FANCL sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

FANCL Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus FANCL dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription FANCL, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de FANCL. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus FANCL natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de FANCL au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie FANCL dans les cellules tumorales présentant une expression de FANCL silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.