Plasmide CRISPR d'Activation (h) Factor V: sc-404180-ACT

Le gène humain F5 code le facteur V de la coagulation, une glycoprotéine plasmatique qui joue le rôle de cofacteur essentiel au sein du complexe prothrombinase afin d’accélérer la génération de thrombine au cours de la voie commune de la cascade de coagulation. Après activation en facteur Va, il s’assemble avec le facteur Xa sur des membranes phospholipidiques de manière dépendante du calcium, amplifiant la formation du caillot et reliant la biologie de la surface plaquettaire à la production de fibrine. L’activité du facteur V est étroitement régulée par une inactivation protéolytique et par des voies anticoagulantes, notamment via la modulation par la protéine C activée. Les variations génétiques ou une expression dérégulée de F5 sont associées à un équilibre hémostatique modifié et sont largement étudiées dans la biologie des troubles thrombotiques et hémorragiques.

Factor V Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de F5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Factor V Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus F5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription F5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Factor V. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus F5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Factor V au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Factor V dans les cellules tumorales présentant une expression de F5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.