EYA1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404056-ACT

Humanes EYA1 (eyes absent homolog 1) kodiert einen transkriptionellen Koaktivator und eine zur Haloacid-Dehalogenase-Familie gehörende Phosphatase, die Entwicklungssignale mit genregulatorischen Programmen verknüpft. EYA1 wirkt zusammen mit SIX- und DACH-Proteinen, um die Organogenese und Zellschicksalsentscheidungen zu steuern, und ist zudem an DNA-Schadensantworten beteiligt, indem es phosphorylierungsabhängige Signalwege moduliert. Eine dysregulierte EYA1-Aktivität oder -Expression wird mit angeborenen Entwicklungsstörungen in Verbindung gebracht, die die Morphogenese von Ohr und Niere betreffen, und wurde in Kontexten untersucht, in denen veränderte Differenzierungs- und Proliferationsprogramme zu Krankheitsphänotypen beitragen. Als nukleo-zytoplasmatischer Regulator stellt EYA1 einen gut untersuchbaren Knotenpunkt dar, um transkriptionelle Kontrolle, Phosphatase-Biologie und das Zusammenspiel von Entwicklungswegen zu erforschen.

EYA1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EYA1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

EYA1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EYA1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EYA1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen EYA1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EYA1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von EYA1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des EYA1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EYA1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.