Plasmide CRISPR d'Activation (h) EXTL1: sc-409470-ACT

L’EXTL1 humain (exostosin-like glycosyltransferase 1) est une enzyme résidente de l’appareil de Golgi impliquée dans l’initiation et l’élongation des chaînes de glycosaminoglycanes d’héparane sulfate sur les protéines cœur des protéoglycanes. En façonnant la structure de l’héparane sulfate, EXTL1 influence l’organisation de la matrice extracellulaire ainsi que les interactions ligand–récepteur qui modulent la signalisation des facteurs de croissance, les gradients de morphogènes et la communication cellule–cellule. Ces processus relient EXTL1 à des voies contrôlant l’adhésion, la migration et la différenciation, dans lesquelles une biosynthèse altérée des protéoglycanes peut affecter l’homéostasie tissulaire. Une assemblage dérégulé de l’héparane sulfate a été associé à des anomalies du développement et à un remodelage de la signalisation lié aux maladies, faisant d’EXTL1 une cible utile pour des études mécanistiques de glycobiologie dans les cellules humaines.

EXTL1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EXTL1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

EXTL1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EXTL1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EXTL1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de EXTL1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EXTL1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de EXTL1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie EXTL1 dans les cellules tumorales présentant une expression de EXTL1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.