EXT1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404635-ACT

O EXT1 humano codifica a exostosina-1, uma glicosiltransferase residente no Golgi que forma um complexo funcional com a EXT2 para catalisar o alongamento das cadeias de heparan sulfato em proteoglicanos. Ao controlar a biossíntese de heparan sulfato, a EXT1 organiza a matriz extracelular e modula a disponibilidade de ligantes para vias de sinalização-chave, incluindo FGF, WNT, Hedgehog e BMP, influenciando a adesão e a migração celulares, bem como a padronização do desenvolvimento. A interrupção ou desregulação de EXT1 altera a composição de proteoglicanos e os gradientes de sinalização, estando fortemente associada a displasias esqueléticas como osteocondromas múltiplos e a defeitos mais amplos na morfogênese dos tecidos. A atividade de EXT1 também é relevante em estudos de remodelamento do microambiente tumoral e de interações receptor–ligante que dependem da apresentação de heparan sulfato.

EXT1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EXT1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

EXT1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EXT1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EXT1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de EXT1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EXT1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de EXT1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via EXT1 em células tumorais com expressão de EXT1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.