Plasmide CRISPR d'Activation (h) Exo84: sc-403472-ACT

L’EXOC8 humain code Exo84, un composant central du complexe d’arrimage exocyste octamérique, qui dirige les vésicules sécrétoires vers des sites définis de la membrane plasmique avant la fusion médiée par les SNARE. Par son rôle dans l’exocytose polarisée, Exo84 soutient des processus tels que l’établissement de la polarité épithéliale, la croissance des neurites, la ciliogenèse et la migration cellulaire dirigée, et il interagit avec la signalisation des petites GTPases (par exemple les voies Ral et Rab) qui coordonnent le ciblage vésiculaire et le remodelage du cytosquelette. Le trafic dépendant de l’exocyste influence aussi l’acheminement à la surface et le recyclage des récepteurs et des transporteurs, modulant ainsi les sorties de signalisation et la composition membranaire. Une dérégulation de la fonction de l’exocyste a été associée, dans des modèles de cancer, à une altération de la polarité cellulaire et à un comportement invasif, ainsi qu’à des défauts d’homéostasie neuronale et épithéliale liés à des phénotypes développementaux et neurodégénératifs.

Exo84 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EXOC8 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Exo84 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EXOC8 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EXOC8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Exo84. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EXOC8 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Exo84 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Exo84 dans les cellules tumorales présentant une expression de EXOC8 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.