Plasmide CRISPR d'Activation (h) Evi-1: sc-404112-ACT

MECOM code le facteur de transcription Evi-1, une protéine à doigts de zinc qui se lie à des éléments régulateurs de l’ADN afin de contrôler les programmes de spécification de lignée, d’auto-renouvellement et de différenciation. Evi-1 influence l’état de la chromatine et les réseaux transcriptionnels impliqués dans l’hématopoïèse et la mise en place des plans de développement, avec des effets en aval sur la prolifération et l’apoptose. Une activité dérégulée de MECOM/Evi-1 est associée à un contrôle transcriptionnel aberrant en cancérologie, en particulier dans les hémopathies malignes, et est également impliquée dans des phénotypes plus larges du développement et du destin cellulaire. Ces propriétés font de MECOM un nœud pertinent pour l’étude des circuits transcriptionnels, de la régulation épigénétique et du remodelage des voies oncogéniques dans les cellules humaines.

Evi-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MECOM sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Evi-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MECOM dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MECOM, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Evi-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MECOM natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Evi-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Evi-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de MECOM silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.