Plasmide CRISPR d'Activation (m) ETBR: sc-420112-ACT

Ednrb code le récepteur de l’endothéline de type B (ETBR), un récepteur couplé aux protéines G qui se lie aux endothélines afin de réguler la signalisation vasomotrice, le développement des cellules dérivées de la crête neurale, ainsi que la biologie des mélanocytes et du système nerveux entérique. L’activation d’ETBR mobilise les voies canoniques des RCPG, notamment la voie Gq/PLCβ/et la mobilisation du Ca2+ ainsi que la signalisation MAPK, influençant la migration cellulaire, la différenciation et l’organisation des tissus. Dans des modèles murins, la fonction d’Ednrb est étroitement liée à la spécification des lignages issus de la crête neurale et à la formation du système nerveux périphérique, et ses perturbations sont associées à l’aganglionose et à des anomalies de pigmentation. Ces propriétés font d’ETBR un nœud pertinent pour étudier la signalisation du développement, la communication cellule–cellule et les interactions entre voies de la cascade de l’endothéline, dans des contextes physiologiques et pertinents pour la maladie.

ETBR Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Ednrb sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ETBR Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Ednrb dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Ednrb, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ETBR. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Ednrb natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ETBR au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ETBR dans les cellules tumorales présentant une expression de Ednrb silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.