Plasmide CRISPR d'Activation (h) ERp72: sc-402689-ACT

Le gène humain PDIA4 code ERp72, une isomérase des disulfures protéiques du réticulum endoplasmique (RE) qui catalyse les échanges thiol–disulfure afin de soutenir le repliement oxydatif et le contrôle qualité des protéines sécrétoires et membranaires naissantes. ERp72 agit au sein du réseau de protéostase du RE aux côtés de chaperons et d’autres PDI, contribuant à la dégradation associée au RE (ERAD) et à l’amortissement des perturbations qui déclenchent la réponse aux protéines mal repliées (UPR). Par ces activités, PDIA4 influence l’homéostasie rédox, le traitement lié à la présentation d’antigènes et la capacité de sécrétion dans des cellules fortement sécrétrices ou soumises à un stress. Une protéostase du RE dérégulée et une activité des PDI altérée sont fréquemment associées à la signalisation inflammatoire, au stress métabolique et à l’adaptation des cellules tumorales, ce qui fait de PDIA4 un nœud pertinent pour disséquer la biologie des réponses au stress.

ERp72 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PDIA4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ERp72 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PDIA4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PDIA4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ERp72. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PDIA4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ERp72 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ERp72 dans les cellules tumorales présentant une expression de PDIA4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.