Plasmide CRISPR d'Activation (h) ERM: sc-401161-ACT

L’ETV5 humain code le facteur de transcription ERM de la famille ETS, un régulateur de la liaison à l’ADN spécifique de séquence qui intègre des signaux extracellulaires pour contrôler des programmes géniques gouvernant la prolifération, la différenciation et la migration cellulaire. ERM agit en aval des voies de signalisation des récepteurs à activité tyrosine kinase, notamment les axes FGF–MAPK/ERK, et contribue à la spécification des lignages ainsi qu’au remodelage tissulaire via le contrôle transcriptionnel d’états développementaux et de type « stem ». Une activité d’ETV5/ERM dérégulée a été associée à des altérations de la différenciation épithéliale et endocrine, et est fréquemment liée à des réseaux transcriptionnels oncogéniques dans de multiples contextes tumoraux. Ces propriétés font d’ETV5 un nœud utile pour étudier les circuits transcriptionnels pilotés par les ETS, l’utilisation d’enhancers dépendante des signaux et la régulation génique spécifique du contexte dans des modèles de cellules humaines.

ERM Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ETV5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ERM Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ETV5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ETV5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ERM. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ETV5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ERM au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ERM dans les cellules tumorales présentant une expression de ETV5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.