Plasmide CRISPR d'Activation (h) ephrin-B3: sc-402767-ACT

EFNB3 code l’éphrine‑B3, un ligand transmembranaire des récepteurs tyrosine kinases Eph, qui médie une signalisation dépendante du contact dans les tissus nerveux et vasculaires. Les interactions éphrine‑B3–Eph régulent le guidage axonal, l’organisation synaptique, la migration cellulaire et la formation de frontières via une signalisation bidirectionnelle mobilisant les GTPases de la famille Rho, les cascades MAPK et les voies de remodelage du cytosquelette. Dans le système nerveux, l’éphrine‑B3 contribue au contrôle de la croissance des neurites et aux processus de répulsion à la ligne médiane, importants pour l’assemblage des circuits et la plasticité. Une signalisation Eph/éphrine dérégulée, notamment via une expression altérée d’EFNB3, a été associée à une motilité cellulaire aberrante et à des phénotypes invasifs dans plusieurs contextes pertinents pour les maladies, ce qui étaye son utilisation comme nœud mécanistique dans des études de voies de signalisation.

ephrin-B3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EFNB3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ephrin-B3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EFNB3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EFNB3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ephrin-B3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EFNB3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ephrin-B3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ephrin-B3 dans les cellules tumorales présentant une expression de EFNB3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.