Plasmide CRISPR d'Activation (h) ephrin-B2: sc-400777-ACT

EFNB2 code l’éphrine‑B2, un ligand ancré à la membrane des récepteurs tyrosine kinases EphB, qui assure une signalisation bidirectionnelle entre cellules. Les interactions éphrine‑B2/EphB régulent le bourgeonnement angiogénique, la spécification artério‑veineuse, le remodelage vasculaire et les signaux de guidage au cours du développement, en coordonnant la dynamique du cytosquelette, l’adhérence et la migration cellulaire. La signalisation s’entrecroise avec des voies contrôlant le remodelage de l’actine et l’organisation des jonctions, notamment les GTPases de la famille Rho et des réseaux de phosphorylation en aval qui façonnent le comportement des cellules endothéliales et périvasculaires. Une activité dérégulée d’EFNB2 a été associée à des altérations de la mise en place du réseau vasculaire et à l’angiogenèse associée aux tumeurs, ce qui en fait une cible pertinente pour des études mécanistiques de la biologie vasculaire et de la signalisation du microenvironnement.

ephrin-B2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EFNB2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ephrin-B2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EFNB2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EFNB2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ephrin-B2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EFNB2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ephrin-B2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ephrin-B2 dans les cellules tumorales présentant une expression de EFNB2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.