Plasmide CRISPR d'Activation (h) ephrin-B1: sc-400873-ACT

EFNB1 code l’éphrine‑B1, un ligand ancré à la membrane des récepteurs tyrosine kinases Eph, qui assure une signalisation dépendante du contact afin de coordonner l’adhérence cellulaire, la formation de frontières et la migration dirigée. L’éphrine‑B1 participe à une signalisation bidirectionnelle Eph/éphrine qui s’entrecroise avec le remodelage du cytosquelette et les voies des GTPases de la famille Rho, influençant la mise en place des tissus, l’organisation épithéliale et le guidage axonal. Une dérégulation de la signalisation d’EFNB1 a été associée à des anomalies du développement et à une altération des programmes de communication cellule‑cellule pertinents pour l’invasion et les métastases cancéreuses. En tant que signal de surface intégrant l’information de position, l’éphrine‑B1 est largement étudiée en morphogenèse, en neurobiologie et dans les interactions tumeur–stroma.

ephrin-B1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EFNB1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ephrin-B1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EFNB1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EFNB1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ephrin-B1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EFNB1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ephrin-B1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ephrin-B1 dans les cellules tumorales présentant une expression de EFNB1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.