Plasmide CRISPR d'Activation (m) ephrin-A5: sc-420123-ACT

Efna5 code l’éphrine-A5, un ligand ancré par glycosylphosphatidylinositol (GPI) des récepteurs EphA, qui médie une signalisation cellulaire dépendante du contact contrôlant le guidage axonal, la migration neuronale et l’organisation synaptique. La signalisation « forward » et « reverse » ephrin-A5–Eph coordonne le remodelage du cytosquelette via les GTPases de la famille Rho et recoupe les voies associées à MAPK/ERK et à PI3K afin de réguler l’adhésion, la répulsion et la formation de frontières tissulaires. Dans les systèmes murins, l’activité d’Efna5 est largement utilisée pour modéliser les mécanismes d’assemblage des circuits neuronaux, la cartographie rétinienne et la mise en place des patrons développementaux. Une signalisation ephrin/Eph dérégulée est impliquée dans des phénotypes neurodéveloppementaux et des programmes anormaux de motilité cellulaire, pertinents pour la biologie des cancers et les recherches sur l’angiogenèse.

ephrin-A5 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Efna5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ephrin-A5 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Efna5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Efna5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ephrin-A5. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Efna5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ephrin-A5 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ephrin-A5 dans les cellules tumorales présentant une expression de Efna5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.