Plasmide CRISPR d'Activation (h) ephrin-A5: sc-402127-ACT

EFNA5 code l’éphrine‑A5, un ligand ancré à la glycosylphosphatidylinositol (GPI) des récepteurs tyrosine kinases EphA, qui assure une signalisation dépendante du contact à la surface cellulaire. Les interactions éphrine‑A5–EphA coordonnent le guidage axonal, la formation des synapses et l’établissement des frontières tissulaires en régulant la dynamique du cytosquelette, l’adhésion cellulaire et des signaux migratoires répulsifs/attractifs via des voies telles que les GTPases de la famille Rho, MAPK/ERK et la signalisation PI3K. Dans des contextes non neuronaux, EFNA5 contribue aux comportements épithélio‑mésenchymateux, au patron de vascularisation et à la modulation du microenvironnement tumoral par une signalisation bidirectionnelle Eph/éphrine. Une activité dérégulée de la voie Eph/éphrine, notamment une expression altérée d’EFNA5, a été associée à une motilité et une invasivité cellulaires aberrantes dans des modèles de cancer, ainsi qu’à des phénotypes neurodéveloppementaux pertinents pour l’assemblage des circuits neuronaux.

ephrin-A5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EFNA5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ephrin-A5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EFNA5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EFNA5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ephrin-A5. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EFNA5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ephrin-A5 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ephrin-A5 dans les cellules tumorales présentant une expression de EFNA5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.