Plasmide CRISPR d'Activation (m) EphB4: sc-420201-ACT

Ephb4 chez la souris code le récepteur tyrosine kinase EphB4, membre du système de signalisation ephrin–Eph, qui assure une communication dépendante du contact entre cellules adjacentes. Les interactions EphB4–ephrin-B2 régulent le développement et le remodelage vasculaires, notamment la spécification artério-veineuse, la migration des cellules endothéliales et les signaux de guidage lors de la mise en place des motifs tissulaires. La signalisation en aval s’interface avec la dynamique du cytosquelette et les voies d’adhérence, en mobilisant les GTPases de la famille Rho, PI3K/AKT, MAPK/ERK et la signalisation des adhésions focales, afin d’influencer le positionnement cellulaire et la formation de frontières. Une signalisation EphB4 dérégulée a été impliquée dans l’angiogenèse pathologique et des phénotypes vasculaires associés aux tumeurs, ce qui en fait une cible pertinente pour des études mécanistiques en biologie du cancer, des modèles de développement et des recherches sur le microenvironnement.

EphB4 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Ephb4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

EphB4 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Ephb4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Ephb4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de EphB4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Ephb4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de EphB4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie EphB4 dans les cellules tumorales présentant une expression de Ephb4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.