Plasmide CRISPR d'Activation (h) EphB3: sc-403039-ACT

EPHB3 code pour la tyrosine kinase réceptrice EphB3, membre du système de signalisation Eph/éphrine, qui assure une communication dépendante du contact entre cellules voisines. EphB3 participe à une signalisation bidirectionnelle coordonnant l’adhésion cellulaire, le remodelage du cytosquelette, la migration et la formation de frontières au cours du développement et de l’organisation des tissus. Par ses interactions avec des ligands éphrine‑B, EphB3 module des voies qui régissent le guidage axonal et l’architecture épithéliale, avec des effets en aval sur les GTPases de la famille Rho et des réseaux de phosphorylation associés. Une signalisation EphB3 dérégulée a été associée à une altération du positionnement cellulaire et à des comportements invasifs en biologie du cancer, ainsi qu’à des modifications de l’agencement des circuits neuronaux dans des contextes neurodéveloppementaux.

EphB3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EPHB3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

EphB3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EPHB3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EPHB3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de EphB3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EPHB3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de EphB3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie EphB3 dans les cellules tumorales présentant une expression de EPHB3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.