Plasmide CRISPR d'Activation (h) EP3: sc-402485-ACT

PTGER3 code le récepteur humain EP3 de la prostaglandine E2, un RCPG (GPCR) qui se couple principalement à Gi afin d’inhiber l’adénylate cyclase et de diminuer l’AMPc, avec un couplage dépendant du contexte à d’autres protéines G pouvant moduler la signalisation MAPK et le Ca2+ intracellulaire. EP3 participe au contrôle, médié par les prostaglandines, de l’inflammation, du tonus vasculaire, de la fonction plaquettaire, de la contractilité du muscle lisse et de la signalisation neuronale, intégrant les signaux des médiateurs lipidiques dans des programmes transcriptionnels et métaboliques spécifiques du type cellulaire. Par ces voies, la signalisation d’EP3 est pertinente dans des modèles de régulation de l’inflammation, de biologie cardiovasculaire et thrombotique, ainsi que de neurophysiologie, et elle est fréquemment étudiée dans des contextes où l’équilibre des récepteurs des prostanoïdes influence les réponses tissulaires.

EP3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PTGER3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

EP3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PTGER3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PTGER3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de EP3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PTGER3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de EP3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie EP3 dans les cellules tumorales présentant une expression de PTGER3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.