EP1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402565-ACT

PTGER1 kodiert den menschlichen Prostaglandin‑E2‑Rezeptor EP1, einen G‑Protein‑gekoppelten Rezeptor, der bevorzugt an Gq/11 koppelt, um das intrazelluläre Ca2+ zu erhöhen und PKC‑abhängige Signalwege zu aktivieren. EP1 integriert Prostanoid‑Signale nachgeschaltet von Cyclooxygenase‑Signalwegen und reguliert dadurch den Tonus der glatten Muskulatur, den epithelialen Ionentransport und neuroinflammatorische Antworten; zudem besteht eine zusätzliche Kreuzkopplung zu MAPK‑Signalwegen und calciumabhängigen Transkriptionsprogrammen. Veränderte PTGER1/EP1‑Signalgebung wurde im Zusammenhang mit entzündungsgetriebenem Gewebeumbau und Schmerzsensibilisierung untersucht und mit einer kontextabhängigen Regulation von Zellproliferation und Migration in Verbindung gebracht. Diese Eigenschaften machen EP1 zu einem nützlichen Knotenpunkt, um PGE2‑responsive Signalnetzwerke und nachgeschaltete Veränderungen der Genexpression in menschlichen Zellmodellen zu untersuchen.

EP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PTGER1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

EP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PTGER1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PTGER1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen EP1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PTGER1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von EP1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des EP1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PTGER1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.