Plasmide CRISPR d'Activation (h) EN1/Engrailed 1: sc-405900-ACT

EN1 (Engrailed 1) code un facteur de transcription à homéoboîte qui régule la mise en place des patrons de développement et la spécification du destin cellulaire au cours du développement embryonnaire, avec des rôles majeurs dans l’organisation de la région mésencéphale–rhombencéphale et la différenciation neuronale. En se liant à des éléments cis‑régulateurs, EN1 coordonne des programmes d’expression génique qui façonnent la morphogenèse, le guidage axonal et le maintien des lignages, en interaction avec des réseaux de signalisation du développement incluant les voies Wnt, FGF et les sorties transcriptionnelles associées à Hedgehog. Dans les tissus adultes et les modèles de maladie, une expression altérée d’EN1 a été associée à des états de différenciation dérégulés et à des circuits transcriptionnels aberrants. Ces caractéristiques font d’EN1 un nœud utile pour étudier les réseaux de régulation génique du développement et le contrôle transcriptionnel dépendant du contexte dans des systèmes cellulaires humains.

EN1/Engrailed 1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EN1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

EN1/Engrailed 1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EN1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EN1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de EN1/Engrailed 1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EN1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de EN1/Engrailed 1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie EN1/Engrailed 1 dans les cellules tumorales présentant une expression de EN1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.