ELKS CRISPR Activationプラスミド (h): sc-404216-ACT

ヒトERC1はELKS（Rab6結合／CASTファミリーの足場タンパク質としても知られる）をコードしており、小胞のドッキングと調節性エキソサイトーシスを組織化する皮質アクティブゾーンの中核構成要素である。ELKSは、小型GTPアーゼシグナル伝達を細胞骨格および膜輸送経路と結び付けるタンパク質複合体の形成を協調し、効率的な神経伝達物質放出と分泌顆粒の融合を支える。ニューロンおよび内分泌細胞において、ELKSはアクティブゾーンやSNARE関連機構との相互作用を介して、シナプス構造の形成、シナプス前終末での放出確率、ならびに刺激依存的な分泌に寄与する。ERC1/ELKSの発現量や局在の変化は、シナプス伝達の破綻やより広範な神経生物学的表現型と関連付けられており、分泌および回路機能を経路レベルで解析する研究における分子学的な足掛かりとしての有用性を支持する。

ELKS CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性ERC1の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

ELKS CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における ERC1 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はERC1転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性ELKSの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のERC1遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるELKS依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびERC1発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるELKS経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。