Plasmide CRISPR d'Activation (h) eIF4AII: sc-402758-ACT

EIF4A2 code eIF4AII, une hélicase d’ARN de type DEAD-box qui agit comme composant central de la machinerie d’initiation de la traduction eIF4F. En déroulant les structures secondaires des régions 5′ UTR et en coordonnant le chargement des ARNm sur les ribosomes, eIF4AII soutient la traduction dépendante de la coiffe et façonne la production protéique en réponse aux signaux de croissance et de stress cellulaires. Son activité est liée à des voies contrôlant la synthèse protéique, le métabolisme de l’ARN et la reprogrammation traductionnelle adaptative au stress, des processus souvent perturbés dans la biologie des maladies associées à la prolifération et au stress. Les altérations du contrôle traductionnel médiées par des membres de la famille eIF4A ont été exploitées pour étudier comment une traduction des ARNm dérégulée contribue à la signalisation oncogénique, à la neurobiologie et aux interactions virus–hôte, sans présumer d’une issue clinique.

eIF4AII Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EIF4A2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

eIF4AII Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EIF4A2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EIF4A2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de eIF4AII. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EIF4A2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de eIF4AII au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie eIF4AII dans les cellules tumorales présentant une expression de EIF4A2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.