EHHADH Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404068-ACT

EHHADH (enoil-CoA hidratase e 3-hidroxiacil-CoA desidrogenase) codifica uma enzima peroxissomal bifuncional que catalisa etapas consecutivas na β-oxidação peroxissomal de ácidos graxos, sustentando o encurtamento de cadeia de acil-CoAs de ácidos graxos de cadeia muito longa e de cadeia ramificada. Por meio de seu papel no catabolismo lipídico e no balanço redox, EHHADH contribui para a comunicação metabólica entre peroxissomos e mitocôndrias e para a regulação da homeostase energética celular. Alterações na expressão ou na atividade de EHHADH têm sido associadas a fenótipos de disfunção peroxissomal e a processos relevantes para doenças metabólicas, incluindo acúmulo de lipídios, estresse oxidativo e adaptação metabólica hepática. Assim, EHHADH é um alvo útil para estudar o metabolismo lipídico dirigido por peroxissomos, a homeostase de organelas e programas transcricionais ligados ao estresse metabólico.

EHHADH O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EHHADH sem alterar a sequência de ADN subjacente.

EHHADH O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EHHADH em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EHHADH, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de EHHADH. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EHHADH nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de EHHADH no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via EHHADH em células tumorais com expressão de EHHADH silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.