Plasmide CRISPR d'Activation (h) EGFR: sc-400015-ACT

Le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) est une tyrosine kinase réceptrice humaine qui, après dimérisation induite par le ligand et autophosphorylation, déclenche des cascades de signalisation contrôlant la prolifération, la survie, la différenciation et la migration cellulaires. EGFR active des voies clés, notamment RAS–RAF–MEK–ERK, PI3K–AKT–mTOR, PLCγ–PKC et JAK–STAT, intégrant les signaux extracellulaires de croissance aux programmes transcriptionnels et métaboliques. Une expression ou une signalisation d'EGFR dérégulée est fréquemment associée à une homéostasie épithéliale altérée et à des phénotypes oncogéniques, ce qui en fait un nœud central de la biologie des récepteurs aux facteurs de croissance. EGFR est également largement utilisé comme récepteur modèle pour étudier le trafic des récepteurs, l'endocytose, la régulation par rétrocontrôle et le dialogue entre voies de signalisation dans des systèmes cellulaires humains.

EGFR Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EGFR sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

EGFR Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EGFR dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EGFR, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de EGFR. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EGFR natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de EGFR au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie EGFR dans les cellules tumorales présentant une expression de EGFR silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.