Plasmide CRISPR d'Activation (h) EFP: sc-402678-ACT

TRIM25 humain code l’E3 ubiquitine‑ligase EFP, une protéine à doigt RING qui régule la signalisation immunitaire innée et le métabolisme de l’ARN par ubiquitination de substrats clés. EFP favorise les réponses antivirales en modulant les voies des récepteurs de type RIG‑I et la signalisation en aval des interférons de type I, et peut influencer l’activation de NF‑κB ainsi que des programmes transcriptionnels sensibles au stress. Au-delà de l’immunité, TRIM25 participe au contrôle post‑transcriptionnel via des interactions avec des protéines liant l’ARN, affectant la stabilité des ARNm et leur traduction. Une activité TRIM25/EFP dérégulée a été associée à une signalisation inflammatoire altérée et à des phénotypes liés aux tumeurs, ce qui en fait une cible pertinente pour des études mécanistiques en biologie des infections, régulation immunitaire et signalisation des cellules cancéreuses.

EFP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TRIM25 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

EFP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TRIM25 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TRIM25, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de EFP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TRIM25 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de EFP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie EFP dans les cellules tumorales présentant une expression de TRIM25 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.