Plasmide CRISPR d'Activation (h) EEA1: sc-400234-ACT

EEA1 (antigène 1 des endosomes précoces) code un effecteur de Rab5 qui agit comme facteur d’arrimage, indispensable à la fusion et à la maturation des endosomes précoces. En se liant au phosphatidylinositol-3-phosphate et en coordonnant l’amarrage des membranes dépendant des SNARE, EEA1 contribue à réguler le trafic endocytaire, le recyclage des récepteurs et l’atténuation des signaux issus de récepteurs internalisés. Cette voie recoupe l’autophagie et le transport cytosquelettique pour contrôler la dynamique membranaire et le tri du cargo. Des altérations du trafic endosomal et de la signalisation dépendante d’EEA1 ont été associées à une dérégulation du renouvellement des récepteurs aux facteurs de croissance et à des réponses au stress cellulaire impliquées dans la biologie du cancer et les mécanismes des maladies neurodégénératives.

EEA1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EEA1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

EEA1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EEA1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EEA1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de EEA1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EEA1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de EEA1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie EEA1 dans les cellules tumorales présentant une expression de EEA1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.