Plasmide CRISPR d'Activation (h) EDD: sc-402123-ACT

UBR5 code pour la protéine humaine EDD, une ligase E3 ubiquitine de type HECT qui régule le renouvellement des protéines et la signalisation par ubiquitination ciblée. EDD participe aux programmes de stabilité du génome en coordonnant la détection et la réparation des dommages à l’ADN, en modulant le contrôle des points de contrôle (checkpoints) et en façonnant les réponses transcriptionnelles au stress cellulaire. Par ces fonctions, elle influence la progression du cycle cellulaire, la tolérance au stress de réplication et les voies de protéostase qui interagissent avec la dynamique du système ubiquitine–protéasome. Une activité UBR5/EDD dérégulée et des variations du nombre de copies ont été associées à des réseaux de signalisation oncogénique altérés et à une capacité de réparation de l’ADN aberrante, ce qui étaye son utilisation comme nœud mécanistique dans les études de biologie tumorale et de transcription adaptative au stress.

EDD Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de UBR5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

EDD Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus UBR5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription UBR5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de EDD. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus UBR5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de EDD au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie EDD dans les cellules tumorales présentant une expression de UBR5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.