Plasmide CRISPR d'Activation (h) EAAT3: sc-401539-ACT

SLC1A1 code le transporteur d’acides aminés excitateurs 3 (EAAT3), un transporteur du glutamate et de l’aspartate à haute affinité, dépendant du sodium, qui contribue à réguler les concentrations extracellulaires d’acides aminés excitateurs et à maintenir la disponibilité intracellulaire du glutamate pour le métabolisme et l’équilibre rédox. L’activité d’EAAT3 participe à l’élimination des neurotransmetteurs, au maintien de l’homéostasie de la signalisation synaptique et à la vulnérabilité neuronale au stress oxydatif via des voies dépendantes du glutamate, qui recoupent l’absorption de cystéine et la synthèse du glutathion. Dans les tissus humains, SLC1A1 est associé à des processus de transport neuronaux et épithéliaux et a été étudié dans le contexte d’altérations de la neurotransmission excitatrice et des réponses cellulaires au stress. Des modifications génétiques et d’expression de SLC1A1 ont été associées à des phénotypes neuropsychiatriques et du neurodéveloppement, ce qui motive des études mécanistiques sur la régulation du transporteur et la signalisation en aval.

EAAT3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC1A1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

EAAT3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC1A1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC1A1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de EAAT3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC1A1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de EAAT3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie EAAT3 dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC1A1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.