Plasmide CRISPR d'Activation (h) EAAT1: sc-400917-ACT

SLC1A3 code pour le transporteur d’acides aminés excitateurs 1 (EAAT1), un transporteur du glutamate et de l’aspartate à haute affinité, dépendant du sodium, qui maintient l’homéostasie du glutamate extracellulaire et limite la signalisation excitotoxique. EAAT1 est fortement exprimé dans les astrocytes et contribue au cycle glutamate–glutamine, en couplant la clairance des neurotransmetteurs au métabolisme énergétique cellulaire et aux gradients ioniques. En modulant la transmission synaptique et en protégeant les circuits neuronaux d’une activité glutamatergique excessive, SLC1A3 influence des processus neurodéveloppementaux et neurodégénératifs. Une expression ou une fonction altérée d’EAAT1 a été associée à une perturbation de la signalisation du glutamate dans des contextes de maladies neurologiques et psychiatriques, ce qui étaye son utilisation dans des études mécanistiques de la neurotransmission excitatrice.

EAAT1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC1A3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

EAAT1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC1A3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC1A3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de EAAT1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC1A3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de EAAT1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie EAAT1 dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC1A3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.