Plasmide CRISPR d'Activation (h) E6BP: sc-409673-ACT

RCN2 code la protéine humaine de liaison à E6 (E6BP), une protéine du réticulum endoplasmique (RE) capable de lier le calcium et impliquée dans l’homéostasie de la voie sécrétoire. E6BP contribue au repliement des protéines dépendant du calcium et au contrôle qualité dans la lumière du RE, ce qui la relie à la signalisation du stress du RE et aux processus associés à la protéostase. Par ces fonctions, RCN2 intervient dans des réponses cellulaires qui modulent le trafic intracellulaire, la sécrétion et des programmes transcriptionnels d’adaptation au stress. Des altérations de la protéostase du RE et de la gestion du calcium sont fréquemment associées à des phénotypes pertinents pour les maladies, faisant de RCN2 une cible utile pour des études mécanistiques de la signalisation du stress et de la biologie de la sécrétion.

E6BP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RCN2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

E6BP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RCN2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RCN2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de E6BP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RCN2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de E6BP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie E6BP dans les cellules tumorales présentant une expression de RCN2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.