Dynein HC CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400919-ACT

DYNC1H1 kodiert die schwere Kette 1 des zytoplasmatischen Dyneins, einen zum Minusende der Mikrotubuli gerichteten Motor, der den Ferntransport von Vesikeln, Organellen, mRNAs und Proteinkomplexen antreibt. Die Aktivität der schweren Dynein-Kette unterstützt die Organisation des mitotischen Spindelapparats, die Positionierung des Zentrosoms, den Transport von Endosomen/Lysosomen sowie den retrograden axonalen Transport durch koordinierte Interaktionen mit Dynactin und Frachtadaptern. Als Kernbestandteil der zytoskelettalen Transportmaschinerie ist DYNC1H1 für die neuronale Aufrechterhaltung und die intrazelluläre Logistik wesentlich, die Polarität, Proteostase und Stressantworten prägen. Genetische Veränderungen von DYNC1H1 wurden mit neuroentwicklungsbezogenen und neuromuskulären Phänotypen in Verbindung gebracht und sind daher relevant für Studien zu Axonopathien, der Vulnerabilität von Motoneuronen und transportabhängiger Signalübertragung.

Dynein HC Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DYNC1H1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Dynein HC Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DYNC1H1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DYNC1H1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Dynein HC-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DYNC1H1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Dynein HC-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Dynein HC-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DYNC1H1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.