DUSP8 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404385-ACT

Die Dual-Spezifitäts-Proteinphosphatase 8 (DUSP8) ist eine MAP-Kinase-Phosphatase, die aktivierte MAPKs dephosphoryliert, und spielt eine wichtige regulatorische Rolle in stressresponsiven Signalwegen über die JNK- und p38-MAPK-Kaskaden. Durch die Feinabstimmung von Stärke und Dauer der MAPK-Phosphorylierung beeinflusst DUSP8 Transkriptionsprogramme, die Proliferation, Apoptose, Differenzierung und Entzündungsantworten steuern. Die durch DUSP8 vermittelte Feedback-Regulation ist in Kontexten relevant, in denen MAPK-Signalgebung umprogrammiert ist, darunter die Krebsbiologie sowie neuroinflammatorische oder neurodegenerative Prozesse, und wird häufig als Knotenpunkt untersucht, der extrazelluläre Stressreize mit der nukleären Genexpression verknüpft.

DUSP8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DUSP8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DUSP8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DUSP8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DUSP8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DUSP8-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DUSP8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DUSP8-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DUSP8-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DUSP8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.