Plasmide CRISPR d'Activation (h) DR5: sc-401002-ACT

TNFRSF10B code pour le récepteur de mort 5 (DR5), un membre de la superfamille des récepteurs du TNF situé à la surface cellulaire, qui se lie à TRAIL pour initier l’apoptose extrinsèque. Après liaison du ligand, DR5 favorise l’assemblage du complexe de signalisation inducteur de mort (DISC), ce qui entraîne l’activation de la caspase‑8 puis des cascades de caspases effectrices en aval, avec une interaction avec l’apoptose mitochondriale via le clivage de BID. La signalisation de DR5 recoupe les voies NF‑κB et MAPK et est modulée par le trafic du récepteur, des récepteurs leurres et des régulateurs anti‑apoptotiques tels que cFLIP et les protéines IAP. La dérégulation de l’expression ou de la signalisation de TNFRSF10B est fréquemment étudiée dans les contextes de survie des cellules tumorales, de cytotoxicité médiée par le système immunitaire et de mécanismes de résistance à l’apoptose.

DR5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TNFRSF10B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DR5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TNFRSF10B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TNFRSF10B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DR5. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TNFRSF10B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DR5 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DR5 dans les cellules tumorales présentant une expression de TNFRSF10B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.