Plasmide CRISPR d'Activation (h) DR4: sc-400747-ACT

TNFRSF10A code le récepteur de mort 4 (DR4), un membre de la superfamille des récepteurs du TNF situé à la surface cellulaire, qui se lie à TRAIL pour déclencher l’apoptose extrinsèque. Après engagement du ligand, DR4 assemble le complexe de signalisation induisant la mort (DISC), favorise l’activation de la caspase‑8 et peut également interagir avec l’apoptose mitochondriale via le clivage de BID, reliant ainsi la signalisation du récepteur à un contrôle plus global du destin cellulaire. L’activité de DR4 s’intègre à des interactions croisées avec les voies NF‑κB et MAPK, susceptibles d’influencer la signalisation inflammatoire et les réponses au stress, ce qui en fait un nœud utile pour étudier des issues de survie versus mort dépendantes du contexte. Des altérations de l’expression de TNFRSF10A ou de la réactivité de la voie ont été rapportées dans divers cancers et contextes liés à l’immunité, étayant des recherches mécanistiques sur la compétence apoptotique, la surveillance immunitaire et les phénotypes de résistance.

DR4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TNFRSF10A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DR4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TNFRSF10A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TNFRSF10A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DR4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TNFRSF10A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DR4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DR4 dans les cellules tumorales présentant une expression de TNFRSF10A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.