Plasmide CRISPR d'Activation (h) DOT1L1: sc-403286-ACT

Le gène humain DOT1L (DOT1L1) code une histone méthyltransférase des lysines qui catalyse la mono-, di- et triméthylation de H3K79, une marque épigénétique associée à la transcription active au sein des corps des gènes. La régulation de la chromatine dépendante de DOT1L favorise l’élongation de l’ARN polymérase II, la communication entre enhancers et promoteurs, ainsi que la coordination de la signalisation des dommages à l’ADN avec la progression du cycle cellulaire. En contrôlant des programmes transcriptionnels spécifiques de lignée, DOT1L influence la différenciation hématopoïétique et, plus largement, des réseaux de gènes du développement. Une activité de DOT1L dérégulée et des états de méthylation de H3K79 altérés sont associés à des reconfigurations aberrantes de l’expression génique observées dans les leucémies et d’autres cancers, ainsi qu’à des effets dépendants du contexte sur la stabilité du génome.

DOT1L1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DOT1L sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DOT1L1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DOT1L dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DOT1L, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DOT1L1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DOT1L natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DOT1L1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DOT1L1 dans les cellules tumorales présentant une expression de DOT1L silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.